GB 7331—87
1 适用范围
本规程适用于各级原（良）种场、科研院校、集体单位和农户生产马铃薯种薯。
2 名词解释
2.1 产地检疫
指种薯生产过程中的全部检疫工作，即4，5章规定的全部内容。
2.2 脱毒种薯
指通过茎尖脱毒培养方法，除去马铃薯花叶型、卷叶型、矮化型病毒（不包括束顶型）的脱毒核心材料（或脱毒苗）在隔离条件下生产的脱毒原原种、脱毒原种级种薯，并经检验合格。
2.3 健康良种
指按照5.3所列方法进行检查和检验，未发现检疫对象，控制病害发生率符合5.3.3所订标准的种薯。
3 检疫对象及控制病害
3.1 检疫对象
3.1.1 马铃薯癌肿病 Synchytrium endobioticum（S chilb）Per。
3.1.2 马铃薯环腐病 Corynebacterium michiganense Pv. S epedonicum （S piechet K otth）S kaptet B urkh。
3.2 控制病害
3.2.1 马铃薯黑胫病 Erwinia Carotovara Pv.atroseptica（rones）〔=Erwinia P hytophora（Appel）Holland〕。
3.2.2 马铃薯花叶型、卷叶型、矮化型病毒病。
4 种薯的生产
4.1 种薯地的选择
4.1.1 种薯地应选在无检疫对象发生的地区或轻发生地区的未发病地块。
4.1.2 留种地确定后，于播种前一月向所在地植检部门申报并填写“马铃薯种薯产地检疫申报表”（见表1）。
表 1 马铃薯种薯产地检疫申报表
申报单位
联系人
繁殖地点
繁殖面积
品种
种薯（或核心材料）来源
播种时期
隔离条件
备注
注：申报表一式三份，一份交植检部门、一份交种薯收购主管部门，一份存繁育单位（或农户）备查。
4.2 脱毒种薯的生产
4.2.1 脱毒核心材料的培育见附录A（补充件）。
4.2.2 脱毒原原种的繁育见附录B（补充件）。
4.2.3 脱毒原种级种薯的高倍繁殖。
4.2.3.1 必须选用附有产地检疫合格证（引进的凭检疫证书，下同）的脱毒原原种（或脱毒原种）为种薯。
4.2.3.2 播种一月前必须进行逐薯块检验。方法见附录C（补充件）。
4.2.3.3 检验合格的种薯用掰芽法繁育。见附录D（补充件）。
4.3 健康良种的生产
4.3.1 以脱毒良种（三代以下脱毒薯）或以三圃提纯复壮后的优良种薯为生产健康良种的种薯，均须附有产地检疫合格证。
4.3.2 播种前将种薯在室内晾7～10天，以汰除暴露出来的病薯。整薯播种选用40～60g小整薯。
4.3.3 切块播种的地方，必须进行切刀消毒。见附录E（补充件）。
4.3.4 亦可选用夏播（或晚播）小种薯直接播种。
4.4 防疫措施
4.4.1 癌肿病发生区应采用以抗病品种为主的高厢畦植并彻底拔除隔生薯。
4.4.2 疫情处理：发现本规程所列病害必须全部拔除病株，挖出已形成的种薯，深埋或烧毁。
4.4.3 药剂防护
4.4.3.1 用25％粉锈宁可湿性粉（或乳油）叶面喷雾防治马铃薯癌肿病。
4.4.3.2 治蚜。田间蚜虫点片发生或有蚜株率5％时，开始药剂防治，每7～10天一次，共2～3次，防止病毒再侵染。
4.4.3.3 田间发现晚疫病“中心病株”，开始药剂常规喷雾，保证田间检查和疫情处理准确进行。
4.4.4 窖藏管理
4.4.4.1 入窖前严格汰除病、烂、伤、杂、劣种薯并经常翻晾。
4.4.4.2 通风窖贮存，贮量不超过窖内空间的三分之一。窖内温度保持在1～3℃为宜，相对湿度75％左右。
4.4.4.3 “死窖”贮藏，冬季封好窖口，严防受冻或受热烂种。
5 检查和签证
5.1 脱毒核心材料必须同时采用指示植物及血清检验（至少两种以上血清方法），确认无病毒者签发产地检疫合格证（见表4）。检验方法见附录F（补充件）。
5.2 脱毒原原种和脱毒原种级种薯的检查
5.2.1 每周肉眼检查一次，若发现病株应及时拔除销毁。对其周围1m以内的植株全部进行血清检测以拔除隐症病株。
5.2.2 收获前一周，脱毒原原种顺行每隔50株，脱毒原种级种薯顺行每隔100株检查一株，并进行血清检验以拔除隐症病株。
5.2.3 对无检疫对象和限制病害者发给产地检疫合格证（见表4）。
5.3 健康良种的检验
以田间检验为主，必要时进行室内复检。
5.3.1 田间检查
5.3.1.1 检查日期。分别于苗高6～7寸、盛花期和收获前各检查一次。
5.3.1.2 检查株数。在观察全田的基础上，根据不同面积随机选点，一亩以下地块检查200株，一亩以上的地块检查总株数不得少于500株。
5.3.1.3 症状鉴别、田间病株和薯块症状，以肉眼观察为主。见附录H（参考件）。
5.3.1.4 检查结果记入田间检查记录表（见表2）。
表 2 马铃薯田间检查记录表
面积 地点
检查项目→
检查次数
↓ 日
期 检
查
方
法 检
查
数
量
发现病株情况
调
查
点
马铃薯
癌肿病 马铃薯
环腐病 马铃薯
黑胫病 马铃薯
病毒病
株（块） ％ 株（块） ％ 株（块） ％ 株（块） ％
一
二
三
薯块
检查
人员意见
5.3.2 室内检验
5.3.2.1 田间不能确诊的植株（或薯块），采集标本作室内检验。方法见附录I（补充件）。
5.3.2.2 检验结果填入产地检验送检标本报告单（见表3）。
表 3 产地检验送检标本报告单
送检 年 月 日 检验 年 月 日
标本编号
检验对象 检验方法 检验结果 检验人 备注
5.3.3 凡经田间检查和室内检验未发现马铃薯癌肿病；最后一次田间检查（含前两次检查曾发现病株已作彻底的疫情处理）未发现马铃薯环腐病；黑胫病病株率0.2％以下，病毒病株率不超过10％者可发给产地检疫合格证（见表4）。
表 4 马铃薯种薯产地检疫合格证
字第 号
一九 年度繁育 品种（脱毒核心材料、原原种、原种级种薯、良种） 亩 万斤（管）经产地检验未发现检疫对象，黑胫病株率 ％，病毒病株率为 ％，符合国家脱毒、健康种薯标准，准予作种用，特发此证。
注：①
本证一式三联，第一联为存根；第二联交制种单位（或农户）；第三联交种子收购部门（或用户）。
②
本证书半年之内有效，但只限本单位（户）该批种薯使用，不得转借他人或弄虚作假，否则以违章调运论处。
③
本证不作检疫证书使用。
5.4 其他要求
5.4.1 以当地植保（植检）部门为主与种子管理和育种单位组成三结合产地检查小组。
5.4.2 详细填写马铃薯产地检疫档案卡片。见附录G（补充件）。
附 录 A
马铃薯脱毒核心材料的培育
（补充件）
A.1 器材与试剂
WS-84-54手提式高压灭菌锅：280ml×280ml，1个；
无菌箱：1个；
紫外灯：1个；
酒精灯：1个；
长镊子：2个；
棒状温度计：5只；
40W日光灯：14只；
培养架：一组；
培养室：30m2；
试管：20×200，6000支；
营养钵：6000个；
聚氯乙烯塑料大棚：30～50m2，一个；
75％酒精；
甲醛；
升汞；
高锰酸钾；
解剖针；
漂白粉溶液；
pH试纸；
MS培养基：配制见下表。
MS 培养基母液配制表
母液
化 合 物
数量
g
加蒸馏水量
ml 配制1L培养
基需母液量
ml
A NH4NO3（硝酸铵）
KNO3（硝酸钾）
KH2PO4（磷酸二氢钾）
MgSO4·7H2O（硫酸镁）
CaCl2·2H2O（氯化钙）
16.5
19.0
1.7
3.7
4.4
1000 100
B FeSO4（硫酸亚铁）
Na2-EDTA（乙二胺四乙酸二钠）
0.557
0.745
100 5
C KI（碘化钾）
Na3NoO4·2H2O（钼酸钠）
CoCl2·6H2O（氯化钴）
CuSO4·5H2O（硫酸铜）
MnSO4·4H2O（硫酸锰）
ZnSO4·7H2O（硫酸锌）
H3BO3（硼酸）
0.083
0.025
0.0025
0.0025
2.23
0.86
0.62
100 1
D
E
F 盐酸硫胺素（B1）
盐酸素（B2）
甘氨酸
0.004
0.005
0.02
100
100
100
10
10
10
G
H 菸酸
肌-肌醇
蔗糖
琼脂
pH
0.005
1.0
30.0
7.0
5.8
100
100
10
10
直接加入
直接加入
注：在配制母液A时最后加氯化钙。
A.2 操作程序
A.2.1 取刚出土幼苗或块茎上的芽，切下1～2cm长一段，放在烧杯里，上面盖好纱布，用自来水冲洗1h，然后移入无菌接种箱内，浸泡在饱和漂白粉溶液中5～10min，取出后用无菌水冲洗2～3次。
A.2.2 将制备好的MS培养基培养液分装于试管，每管10ml，试管口用包纱布棉花球塞紧，放入硫酸纸袋中（每袋10～20支）在0.8～1kgf/cm2高压锅中消毒15min，冷却后放入无菌接种箱待用。
A.2.3 操作前操作室、工作台面、操作工具等用福尔马林（甲醛）熏蒸，然后用紫外线照射20～40min，工作人员着清洁工作服，手进入接种箱前用肥皂洗净并用70％乙醇擦拭消毒。
A.2.4 将幼苗切段放在40倍双筒解剖显微镜下，用解剖针去掉幼叶，直至露出半光滑的生长点，用解剖刀从0.1～0.3mm处切下，接到试管内培养基上，每个试管接三茎尖，接后在试管上端外面纸帽上注明处理和接种日期。
A.2.5 把接种好的试管从无菌箱中移出置于21～25℃、光照3000～4000cd条件下培养。
附 录 B
马铃薯脱毒原原种的繁育
（补充件）
B.1 器材与试剂
同附录A。
B.2 繁育材料
经检验合格的脱毒核心材料（试管苗，下同）若干管。
B.3 操作程序
B.3.1 将配备好的MS培养基培养液分装于试管中，每管10ml，放入高压灭菌锅灭菌处理15min，冷却待用。
B.3.2 工作台面和工具用70％乙醇擦拭消毒；盛试管苗培养基的试管用1％升汞表面消毒后放入无菌接种箱。
B.3.3 工作人员着清洁工作服，双手用肥皂洗净，伸入无菌箱后用70％乙醇棉擦拭消毒，长把镊子和剪子每次使用前都应在酒精上燃烧消毒。
B.3.4 把试管苗木植株按节剪断，每颗带一叶片，然后腋芽向上插于另一试管内培养基上，烤干管口，用棉球塞紧管口。
B.3.5 插完的试管拿出无菌箱，用牛皮纸包好管口，放于试管架上，在温度21～25℃，光照3000～4000cd条件下培养。
B.3.6 按细砂∶腐熟马粪∶耕层熟土=15∶30∶55配制营养土，分装于营养钵中。
B.3.7 当试管内小植株高5～10cm时，去掉纸帽和棉球煅炼1～2天，移植到钵内，置于大棚内在温度
20℃下假植。
B.3.8 假植苗株高10～15cm时，放入网室定植。
B.3.9 加强水肥管理，发现蚜虫即用1∶1500乐果常规叶面喷雾，每隔7天喷1次，直到无蚜虫为止。
附 录 C
脱毒原原种的薯块检查
（补充件）
C.1 设备和材料
C.1.1 培养室：30m2左右。
C.1.2 培养架：一组。
C.1.3 木制（或塑料）培养盘（如图C1）若干个，每个60孔，每孔10cm2。
图 C1
C.1.4 按无病土：腐熟粪肥：细砂＝7∶2∶1配制床土。床土含水量保持20％左右。
C.1.5 白瓷盘（30×50cm）一组。
C.1.6 小杯（口径2.5～3.5cm）1000个左右。
C.2 操作程序
C.2.1 将配制好的床土装入培养盘的小方格，每小方格装床土五分之四以下。
C.2.2 将应检薯块统一编号。
C.2.3 取每个薯块的一个顶芽（如图C2），放在白瓷盘相应编号位置的小杯内，用0.3％的2-氯乙醇液浸渍30min后，移入相应编号的培养盘方格内。
图 C2
C.2.4 将培养盘移入培养室的培养架上，培养室温度维持在20℃左右，培养架应置于阳光充足的地方，适时浇水。
C.2.5 待薯芽长到20～23cm时，逐株肉眼鉴定，病状参照附录H。发现有病或疑似有病的相应薯块应淘汰，有条件的可进行逐株血清检测。
附 录 D
原种级种薯的高倍繁殖（掰芽法）
（补充件）
D.1 配制床土
同附录C中C.1.4。
D.2 操作程序
D.2.1 将种薯按芽切块放在床土中，芽床温度维持在15～20℃，床土含水量为20％左右。
D.2.2 薯芽长到4～5cm时掰下，插入营养钵里，母薯继续在苗床催芽，一个芽眼可掰二次芽。操作时手用肥皂水洗干净。
D.2.3 营养钵在常温下，当苗长到15cm左右时，移入播种地定植生产一代以后种薯。
D.2.4 播种地选择在500m内无马铃薯主要病毒病寄主作物的地方。
附 录 E
切刀消毒操作程序
（补充件）
E.1 器材
切刀：2把；
搪瓷盆（或塑料盆）：2个；
大筐（或席）：1个（或一领）；
消毒药液：2000ml（0.1％酸性升汞、0.1％高锰酸钾、75％乙醇、5％的碳酸任选一种即可）。
E.2 操作程序
E.2.1 将对好的药液倒入盆中，将切刀柄朝上浸入药液中。
E.2.2 先取出一把切刀，切完一个种薯，放回药液；取另一把切刀，再切完一个种薯，又放回药液。如此两把刀不断交替使用。
E.2.3 切薯块时，边切边肉眼观察切面，发现病薯或可疑薯块全部淘汰。
E.2.4 切好的薯块放在清洁大筐里（或苇席上）备用。
附 录 F
几种主要马铃薯病毒的检验方法
（补充件）
F.1 玻片点滴凝聚法（利用粗制抗血清）检验马铃薯PVX病毒
F.1.1 取被检株中、上部叶片放入研钵中，再按1∶1加入中性磷酸缓冲液研磨，用双层纱布过滤，滤液备用（也可用中性磷酸缓冲液浸湿纱布，折成双层，包住样品揉挤拧汁备用）。
F.1.2 用滴管吸取样品汁液滴于载玻片上，左右各一滴。
F.1.3 取被0.85％生理盐水稀释到5到10倍的抗血清和正常血清各一滴，抗血清滴于玻片右边样品汁液上，正常血清滴于左边样品汁液上，置于20℃左右的常温下2～3min，若右边汁液边缘出现大块凝聚颗粒，证明带有X病毒，无凝聚颗粒证明被检株无X病毒。
F.2 乳酸凝聚试验
把某一特异性的病毒抗血清中提纯出的免疫球蛋白，吸附在均一的乳胶颗粒表面，当这种致敏的乳胶颗粒遇到相应的被鉴定抗原时，就会产生凝聚。
F.2.1 被检植物汁液的榨取方法
取供试样品叶片约1g，按1∶10（重量/容积）的比例加入含0.85％氯化钠的0.1MTris盐酸缓冲液，在研钵内研碎。以3000r/min离心15min，取上清液供鉴定用。
或将1g叶片样品研碎，用一薄片脱脂棉挤压过滤，用吸管吸取1滴汁液加入0.5ml的0.1MTris盐酸缓冲液，供鉴定用。
F.2.2 用双凹载玻片或用油笔在一般玻片上划两个圆圈，用滴管吸取被检植物汁液滴在一侧的凹中或圆圈上；用另一滴管吸取一滴阴性对照或阳性对照的汁液，滴在另一侧。
F.2.3 吸取乳胶致敏的抗血清滴加在被检植物汁液和对照的植物汁液上，轻轻摇动混匀。然后把玻片放到培养皿中，盖好上盖。
F.2.4 把培养皿放置在23℃温度条件下15～30min，在这当中还可再轻轻摇动一、二次。有微型振荡机时，可把培养皿放置于振荡机上振荡。
F.2.5 用扩大镜观察，出现颗粒凝聚者为阳性，证明带有X病毒；纤细的乳胶颗粒均匀分布者为阴性，证明被检株无X病毒。
F.3 酶联免疫吸附测定植株病毒（PSTV除外）
F.3.1 取被检植株上部叶片（在马铃薯开花期）5～10g，加入中性磷酸缓冲液研磨，取汁液和包被缓冲液混匀，榨叶汁备用。
F.3.2 在编号的塑料微量多孔平底反应板上，每孔滴入200μl被检株汁液，在37℃下置2h（或4℃下24h），并设已知病毒为阳性对照，健康叶汁为阴性对照。
F.3.3 弃包被液后，每孔用洗涤缓冲液漂洗三次，每次5min。
F.3.4 去洗液后每孔加稀释好的（稀释液为生理盐水，稀释2～3倍）抗血清200μl，在37℃下置2h。
F.3.5 去血清后按F.3.3洗涤三次。
F.3.6 每孔加经稀释50～80倍的酶标血清200μl，在37℃下置2h。
F.3.7 弃酶标后按F.3.3洗涤三次。
F.3.8 去洗液后每孔加入200μl底物缓冲液，在37℃下置15～45min。
F.3.9 每孔加入50μl2M硫酸终止反应。
F.3.10 小孔内出现黄褐色反应为阳性，被检株带病毒。
注：① 底物缓冲液的配法：
A液：0.1M柠檬酸2.00ml；
B液：0.2M磷酸氢钠200ml；
30％双氧水80μl；
邻苯二胺20mg。
底物缓冲液＝24.3mlA液＋25.7mlB液＋80μl双氧水＋20mg邻苯二胺。
② 包被缓冲液：
1.59g炭酸钠+2.93g炭酸氢钠+1000ml水调pH=9.6。
③ 稀释缓冲液：
8g氯化钠＋0.2g磷酸二氢钾＋2.9gNa2HPO4·12H2O＋1000ml水调pH＝7.4，再加0.2g氯化
钾，0.5mlTween－20混合后，从中取100ml加1g牛血清蛋白，4℃贮存。
④ 洗涤缓冲液（PBS-Tween-20）：
8g氯化钠+0.2g磷酸二氢钾+2.9gNa2HPO4·12H2O＋0.2g氯化钾＋0.5mlTween－20＋水1000ml，调pH＝7.4。
F.4 利用鉴别寄主检验X、Y、S、G、A、M、PSTV病毒
F.4.1 在20℃左右，防蚜条件下盆栽千日红、心叶烟、香料烟和莨菪若干。
F.4.2 按F.1.1制备被检汁液。
F.4.3 用汁液摩擦接种法先在指示植物叶片上用小型喷粉器轻轻喷上一层金岗砂（400筛目），然后用已消毒的棉球沾被检株叶或芽汁，在指示植物叶片上轻轻摩擦，用清水洗掉叶片上的杂物，置于20～24℃左右，3～7天后逐日观察症状。
马铃薯病毒在主要指示植物上的症状
检测病毒
接毒后检查时间
指示植物
表 现 症 状
PVX
PVM
PVS
PVG
PVY
PVA
PSTV 5～7天
12～24天
14～25天
20天
7～10天
7～10天
5～15天 千日红
千日红
千日红
心叶烟
普通烟
香料烟
莨菪 叶片出现红环枯斑
接种叶片出现紫红色小圆枯斑
接种叶片出现桔红色小斑点，略微凸出的圆或
不规则小斑点
系统白斑花叶症
初期明脉，后期沿脉出现纹带
微明脉
沿脉出现褐色坏死斑点
F.5 利用苯酚测定PLRV（卷叶病毒）
F.5.1 按F.1.1制备被检株汁液。
F.5.2 取被检汁5g放入清洁指形管，并加入5ml6％苯酚溶液，摇匀后静置5～10min到叶绿素和细胞残体沉淀为止。
F.5.3 去掉上层液体，在沉淀物里加入5ml清水。
F.5.4 观察结果
若产生沉淀液，表示被检株不带PLRV，产生混浊液表示被检株带有PLRV。
附 录 G
马铃薯种薯产地检疫档案卡片
（补充件）
马铃薯种薯产地检疫档案卡片见下表。
地块
检查
年 月 日
品种
种薯来源 播种日期 消毒办法
田间检验
室内检验
检查人
病害株率
％
株 结果
附 录 H
马铃薯病害田间症状鉴别
（参考件）
马铃薯病害田间症状鉴别见下表。
发病部位
马铃薯
癌肿病 马铃薯
环腐病 马铃薯
黑胫病
马 铃 薯 病 毒 病
卷叶型 花叶型 矮化型 束顶型
茎
叶 在高度感病的品种中主枝与分枝、分枝与分枝或枝叶的腋芽、茎尖等处，长出一团团密积的卷叶状组织的瘤，形似花叶菜花，绿色，后变褐，最后变黑腐烂脱落，茎杆、花梗上和叶背、花萼背面长出无叶柄、绿色、有主脉无枝脉的丛生小叶 现蕾后陆续出现萎型，顶叶变小，叶缘向上卷曲，叶
色变淡呈灰绿，茎杆一株或数枝萎垂倒黄化枯死，但枯死后叶片不脱落 苗期6～7寸始表现植株矮化，叶片退绿黄化，茎部呈黑腐，表皮组
织破裂，后期形成“黑脚”，极易从土壤中拔除 叶片向上卷曲，变厚，呈匙状，质地硬脆。个别品种病变处呈紫红色或退绿变黄。注意经卷叶（顶部显症）沿中脉包起来。严重的矮化（减产80％左右）。有时有复合侵染，紫点加卷叶 叶片表现退绿区域或黄绿相间的花叶，病变不受叶脉限制，有的叶脉坏死呈黑褐色坏死条 斑，也有的产生黄色斑驳的花叶症状 病株分枝丛生，萎缩，叶片变小。有时顶端叶片黄化。还有一种矮皱、束顶 叶柄角度变小，多呈锐角，向上竖起，上部叶片变小
薯
块
茎基部、匍匐茎、薯块上形成形状不一的瘤，似花椰菜，质碎易断，为乳白色或近似薯块的颜色，以后逐变为粉红或褐色，最后变黑而腐烂
尾脐部皱缩凹陷，可挤出乳黄色菌脓，多有皮层分离
病组织呈灰黑色并常形成黑孔
块茎小，皮裂
圆变长呈纺锤形表皮多出现裂纹
附 录 Ｉ
几种主要真菌细菌病害的检验方法
（补充件）
I.1 马铃薯癌肿病的室内检验
I.1.1 显微镜检验
用接种针挑取病组织或作横断面切片，在显微镜下检查，若发现菌原孢囊堆、夏孢子堆或休眠孢子囊为马铃薯癌肿病。
I.1.2 染色法检验
I.1.2.1 将病组织放在蒸馏水中浸泡半小时；
I.1.2.2 用吸管吸取上浮液一滴放在载玻片上；
I.1.2.3 加1％的锇酸或0.1％升汞水一滴固定，在空气中自然干燥，再用1％酸性品红或1～5％龙胆紫一滴染色1min；
I.1.2.4 洗去染液镜检，可见到单鞭毛的游动孢子。
I.2 马铃薯环腐病的室内检验
用革兰氏雷氏（Rocicot）染色法。
I.2.1 试剂
a. 结晶紫（或龙胆紫）：2.5g；
水：1000ml；
b. 碳酸氢钠：12.5g；
水：1000ml；
c. 碘：20g；
氢氧化钠（1N）液：100ml；
水：900ml；
将碘先溶于氢氧化钠溶液中，然后加水稀释。
d. 乙醇（95％）：750ml；
丙酮：250ml；
e. 碱性晶红（95％乙醇饱和溶液）：100ml；
水：900ml。程序
I.2.2 操作
I.2.2.1 在被检标本的病部挑取细菌溢作涂片，用I.2.1中a、b等量混合染色10s，除去染液后用I.2.1中c处理10s。
I.2.2.2 水洗后用I.2.1中d处理5～10s，到颜色洗下为止。
I.2.2.3 用I.2.1中e处理2～3s，水洗，干燥后镜检，病菌被染成紫色为马铃薯环腐病。
I.2.3 为核对技术上的误差，最好用已知染色反应作对照。
|
